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Conhecidas como 'operárias das matas', as abelhas meliponas são responsáveis pela germinação de quase 90% das flores e são essenciais no processo de reflorestamento.

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Abelhas meliponas ajudam no reflorestamento.

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ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E IDENTIFICAÇÃO RUTINA DO MEL PRODUZIDO PELA ABELHA SEM FERRÃO MELIPONA COMPRESSIPES MANAOSENSIS E MEL COMERCIAL

Renah Boanerges de Q Pimentel ¹ ,  Cristovão A da Costa ² ,  Patrícia M Albuquerque ^1 , 3 e  Sergio D júnior ^1 , 3 *

• * Correspondente autor: Sergio D Júnior  sjunior@uea.edu.br

Autor Filiações

¹ Universidade do Estado do Amazonas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Recursos Naturais da Amazônia, Av. Prof. Carvalho Leal, 1777, Manaus, AM, 69,065-170, Brasil

² Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Av. Prof. André Araújo, 2936, Manaus, AM, 69,060-000, Brasil

³ Universidade do Estado do Amazonas, Escola Superior de Tecnologia, Laboratório de Química Aplicada à Tecnologia, Av. Prof. Darcy Vargas, 1200, Manaus, AM, 69050-020, Brasil

Para todos os e-mails de autor, por favor  logon .

BMC Medicina Complementar e Alternativa  2013,  13 : 151  doi: 10.1186/1472-6882-13-151

A versão eletrônica deste artigo é a completa e pode ser encontrado online em: http://www.biomedcentral.com/1472-6882/13/151

Recebido:	3 de novembro de 2012
Aceito:	24 de junho de 2013
Publicado em:	01 de julho de 2013

© 2013 Pimentel et al;. Licenciado BioMed Central Ltd. 

Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Creative Commons Attribution License ( http://creativecommons.org/licenses/by/2.0 ), que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que a obra original é adequadamente citados.

Abstrato

Fundo

O mel tem sido identificada como uma alternativa potencial para a utilização generalizada de antibióticos, que são de preocupação significativa considerando a emergência de bactérias resistentes. Neste contexto, este estudo teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana de amostras de mel produzido por uma espécie de abelha sem ferrão e por  Apis  sp. contra as bactérias patogénicas, assim como para identificar a presença de compostos fenólicos.

Métodos

Amostras de mel de abelha sem ferrão  M. compressipes manaosensis  foram coletadas duas vezes, durante as estações seca e chuvosa. Três amostras de mel comercial de  Apis  sp. Também foram incluídos neste estudo. Dois ensaios diferentes foram realizadas para avaliar o potencial anti-bacteriano das amostras de mel: em ágar e de difusão macrodiluição. Extracção líquido-líquido foi usado para avaliar os compostos fenólicos de mel. A análise por HPLC foi realizada a fim de identificar a rutina e apigenina em amostras de mel. Cromatogramas foram registrados em 340 e 290 nm.

Resultados

Duas amostras de mel foram identificados como tendo a maior atividade antimicrobiana pelo método de difusão em ágar. Mel produzido por  Melipona compressipes manaosensis  inibiu o crescimento de Staphylococcus aureus, Escherichia coli  (0157: H7),  Proteus vulgaris, Shigella sonnei e Klebsiella sp .  Uma amostra de mel produzido por  Apis  sp. também inibiu o crescimento de  Salmonella paratyphi . A técnica de macrodiluição apresentou maior sensibilidade para o teste anti-bacteriano, uma vez que todas as amostras de mel mostraram atividade. Flavonóide rutina foi identificado na amostra de mel produzido pela abelha sem ferrão.

Conclusões

As amostras de mel testadas neste trabalho mostraram actividade antibacteriana contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Os resultados relatados aqui destacar o potencial do uso de mel para controlar o crescimento bacteriano.

Palavras-chave: 

Mel, abelha sem ferrão;  Melipona  sp;  Apis  sp; atividade antibacteriana; flavonóides, HPLC

Fundo

O mel é um adoçante natural disponível em todo o mundo [ 1 ]. O potencial antimicrobiano deste produto natural, foi descrita pela primeira vez há um século. No entanto, apenas recentemente, esse conhecimento foi submetido a uma avaliação científica rigorosa.

Cooper et al. [ 2 ], um estudo realizado em feridas infectadas, onde o principal objectivo foi o de estender o conhecimento limitado da susceptibilidade à exposição ao agente patogénico mel, juntamente com a avaliação da eficácia do mel contra organismos resistentes, a fim de explorar o seu mecanismo de ação. Os autores utilizaram 18 cepas de meticilina-resistente  Staphylococcus aureus  (MRSA), e sete cepas de vancomicina sensíveis  Enterococcus faecalis  isoladas de feridas infectadas. Todas as estirpes foram consideradas sensíveis à manuka e pastagem amostras de mel, em  in vitro  experiências, demonstrando que o mel pode ser utilizado como um anti-séptico eficaz da ferida, com um largo espectro de actividade antimicrobiana.

Hoje em dia, é reconhecido que a maioria dos tipos de mel têm uma actividade antibacteriana e que esta actividade é dependente de factores físicos e químicos. A viscosidade de mel é suficientemente elevada para criar um barril física que inibe a contaminação da ferida por agentes infecciosos presentes no ar. Devido à sua alta concentração de açúcar, mel elimina a maioria das bactérias por osmose. A actividade antibacteriana também pode ser parcialmente atribuído à acidez do mel, a presença de componentes fitoquímicos tais como os flavonóides e os ácidos ftálico e, mais importante, a acção de peróxido de oxigénio, produzidos em mel, devido à presença da enzima glucose oxidase secretado pelas as glândulas hipofaríngeas de abelhas [ 3 ].

Osmose e peróxido de hidrogênio têm sido considerados como os principais fatores responsáveis ​​pela atividade antibacteriana do mel [ 4 ]. No entanto, a verificação da actividade antibacteriana não-peróxido de mel diluído a baixas concentrações, tem chamado a atenção para a presença de outros agentes antibacterianos [ 5 ].

Entre os componentes químicos em mel, que pode ser responsável pela actividade antibacteriana, os flavonóides e ácidos fenólicos são os mais estudados. Uma das razões para tal interesse é que essas moléculas apresentam inúmeros tipos de actividade biológica, incluindo propriedades antibacterianas [ 6 ]. Vários pesquisadores verificaram a atividade antibacteriana dos flavonóides isolados de mel e proeminente resultados foram relatados para o mel Manuka da Nova Zelândia. Os autores descobriram que syringate metil é o principal constituinte da fração fenólica de Manuka Honey (aproximadamente 70% w / w), que apresentou atividade antibacteriana [ 7 ]. Esta actividade é provavelmente devido à capacidade de os flavonóides de formar complexos com as proteínas solúveis e com a parede celular de bactérias[ 6 ].

Nos últimos anos, o aumento do número de grupos de investigação dedicada a estudar a actividade antibacteriana de mel pode ser observado, o qual promoveu a publicação de vários papéis relativamente a esta actividade e verificar a sua eficácia. Estes resultados também têm promovido o interesse de empresas dedicadas à comercialização de alto nível de atividade antibacteriana do mel, que têm fornecido apoio financeiro para a pesquisa nesta área, especialmente sobre os ensaios clínicos.

Actualmente, cerca de 20 mil espécies de abelhas no hábito dos mais diversos ecossistemas em todo o mundo. As abelhas da subtribo Meliponina são conhecidas como abelhas indígenas sem ferrão, e do gênero  Melipona Illiger , 1806, tem um elevado número de espécies, distribuídas ao longo da região neotropical, com maior diversificação na Amazônia [ 8 ]. O mel produzido por estas abelhas é considerado exótico, com um sabor característico e aspecto. Por esta razão, tornou-se um produto com alta demanda do mercado, conseguindo preços mais elevados do que o mel produzido por abelhas do  Apis gênero, comercializados em diferentes regiões do Brasil. Apesar da existência de extensa literatura sobre os diferentes aspectos da biologia das abelhas sem ferrão brasileira [ 9 ], ainda existem poucos estudos que abordam as características físico-químicas e propriedades farmacológicas de seu mel, necessários para definir padrões de qualidade para a sua comercialização.

A determinação do potencial antimicrobiano do mel de abelhas sem ferrão da Amazônia poderia identificar este mel como uma atraente alternativa de baixo custo para o tratamento de infecções bacterianas, juntamente com a possibilidade de promover uma cadeia de produção para estes produtos de abelhas nativas. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi investigar a atividade antibacteriana e do perfil de flavonóides do mel produzido pela abelha nativa sem ferrão  Melipona compressipes manaosensis .

Métodos

Amostras de mel

Amostras de mel de abelha sem ferrão  M. compressipes manaosensis  (Apidae, Meliponinae) foram fornecidos pelo Grupo de Pesquisa em Abelhas (GPA) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), em Manaus, Amazonas (mel A). Amostras de mel foram coletadas duas vezes, durante as estações seca e chuvosa. A colheita ocorreu em março de 2009 (estação seca) e novembro de 2009 (período chuvoso). Foram coletadas três amostras de cada temporada.

Estes  Melipona  espécies manter o mel em compartimentos dentro das colméias, conhecido como potes, e por esta razão foi utilizada uma adaptação 20 mL seringa contendo um tubo estéril para retirar o mel dos potes. Este procedimento foi levado a cabo por técnicos treinados ACP. O mel foi retirado imediatamente armazenados em recipientes estéreis de vidro escuro para evitar a fotodegradação, e mantida a 5 ° C.

Três amostras de mel comerciais também foram incluídos neste estudo: o mel de eucalipto (predominante floração) do Rio Grande do Sul (Mel B); mel produzido por Apis  sp. abelhas do Ceará (mel C), e mel produzido pelas abelhas sem ferrão conhecidas como Jandaíra ( M. subnitida , Apidae, Meliponinae), produzido pelos apicultores da comunidade da Reserva de Desenvolvimento Sustentável do Tupé (RDS Tupé), localizado na zona rural de Manaus (mel D). A colheita de BD mel ocorreu em 2009.

Cepas bacterianas

Estirpes de  Staphylococcus aureus ,  Escherichia coli  (O157: H7),  Proteus vulgaris, Shigella sonnei, Salmonella paratyphi e Klebsiella  sp. foram gentilmente cedidas pelo Laboratório de Virologia Tropical do INPA. As culturas bacterianas foram mantidas em agar nutriente a 36 ° C.

As cepas bacterianas foram previamente testados quanto à sua sensibilidade aos antibióticos, como mostra a Tabela 1 .

Tabela 1.  susceptibilidade aos antibióticos apresentados por diferentes estirpes bacterianas utilizadas no presente trabalho

Ensaios de atividade antibacteriana

Para os ensaios antimicrobianos as estirpes bacterianas foram cultivadas durante a noite em caldo de Mueller-Hilton a 36,5 ° C. A concentração de bactérias foi padronizada a 3 x 10 ⁸  CFU ml ^-1  utilizando a escala de McFarland.

Neste estudo de dois ensaios diferentes foram realizadas para avaliar o potencial anti-bacteriano das amostras de mel: em ágar e de difusão macrodiluição.

Para o ensaio de difusão em poço de Mueller-Hilton meios sólidos foi preparada em placas de petri, seguido por tratamento em autoclave a 121 ° C durante 20 min.Cerca de 5 ml do meio esterilizado foi vertida em pratos (65 x 15 mm), num ambiente asséptico. O teste de difusão foi realizada de acordo com Hernández et al. [ 10 ], com algumas modificações. Sete poços, de 3 mm, foram feitas em meio agarized após a inoculação com as estirpes bacterianas. Amostras de mel foram diluídos em água bidestilada, nas proporções de 1:1, 1:2, 1:4 e 1:8 (v / v). Os poços foram cheios com 30 ul das amostras de mel (amostras diluídas, as amostras não diluídas e de água bidestilada, como controlo negativo). As placas foram incubadas a 36,5 ° C durante 24 h antes de avaliação visual das zonas de inibição. A experiência foi repetida três vezes. A quantificação da inibição do crescimento microbiano foi determinada medindo o diâmetro das zonas claras de crescimento microbiano em torno dos poços no agar (incluindo o próprio poço). A concentração inibitória mínima (CIM) foi considerada a concentração mais baixa capaz de inibir o crescimento bacteriano visível.

Para o ensaio de macrodiluição bacteriana, quantidades apropriadas de amostras de mel e o caldo de cultura para se obter as concentrações desejadas (1:1, 1:2, 1:4, 1:06 e 1:08, v / v), foram colocados no interior tubos de 5 ml. O inoculo bacteriano padronizado (30 mL) foi vertida sobre os tubos, homogeneizada e incubou-se a 36,5 ° C durante 24 h. As amostras retiradas dos tubos foram inoculados em placas de Petri contendo ágar nutriente para verificar o crescimento bacteriano. A inibição do crescimento bacteriano era visível como um caldo claro e a presença de crescimento foi detectada pela presença de turbidez. O controlo positivo foi o tubo contendo o caldo de cultura e o inoculo bacteriano, o controlo negativo continha o caldo de cultura e a amostra de mel. A experiência foi repetida três vezes.

Concentração bactericida mínima (CBM) de mel

O MBC é a concentração mais baixa de mel capaz de matar uma população bacteriana. Foi determinado utilizando os tubos incubados a partir do ensaio de macrodiluição, onde uma amostra de 100 ul de cada tubo foi inoculado em placas de Petri contendo ágar nutriente. As placas foram incubadas a 36,5 ° C durante 24 h.A MBC foi considerada a concentração mais baixa de mel onde nenhum crescimento bacteriano foi observado na superfície do ágar (99,9% de morte bacteriana) [ 11 ].Todos os testes foram repetidos três vezes.

A análise estatística

Todos os resultados experimentais foram expressos como média ± desvio padrão (DP) de três determinações. A presença de uma diferença significativa entre as amostras de mel foi determinada por one-way ANOVA seguido pelo teste de Tukey (p ≥ 0,05) comparação utilizando BioStat 5.3.5.

Extração de compostos fenólicos de mel

Extracção líquido-líquido com acetato de etilo, foi usado, de acordo com a metodologia descrita por Wahdan [ 12 ]. Uma solução de estoque de 20% de mel foi preparada em água destilada, e depois de se separar de 50 ml desta solução, o pH foi ajustado a 3,5. Para esta 50 ml de alíquota de 50 ml de acetato de etilo e 1 g de cloreto de sódio foi adicionado num funil de separação. O funil foi agitada durante 5 min, para a extracção de compostos fenólicos. A fracção de acetato de etilo foi, então, retirado e armazenado num tubo de ensaio. Este procedimento foi repetido três vezes. Após a extracção, a 150 ml de extracto de acetato de etilo mel, foi obtido e submetido a evaporação sob vácuo a 30 ° C. O extracto concentrado foi armazenado a -18 ° C.

Preparação de amostras para cromatografia

Uma alíquota (2 ml) de cada amostra concentrada foi recolher com uma seringa de 5 ml estéril e filtrados através de membranas de Teflon de 0,45 um. As amostras filtradas foram armazenadas em frascos esterilizados de 2 mL. Antes da injecção na coluna de cromatógrafo, 400 uL das amostras foram adicionadas a 600 mL de metanol previamente filtrada.

Preparação de padrões

A apigenina (5 mg) e pinocembrin (25 mg) foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co. O padrão rutina foi gentilmente doado pelo Laboratório de Fitoquímica da Universidade Federal do Amazonas (UFAM). As soluções concentradas foram preparadas por dissolução de cada composto no metanol de grau HPLC. A apigenina e rutina, foram diluídos em 10 ml de metanol e pinocembrina foi dissolvido em 50 ml do solvente. As soluções-padrão foram filtradas através de membranas de Teflon de 0,45 e injectado no cromatógrafo de coluna sob as mesmas condições de análise utilizadas para as amostras de mel.

Cromatografia líquida de análise de alta performance (HPLC)

A análise foi realizada num sistema de HPLC Varian equipado com um amostrador automático. Para a separação dos componentes fenólicos foi utilizado um de fase inversa C-18 de coluna (150 x 4,6 mm x 1/4). A fase móvel consistiu de um sistema de gradiente isocrático como descrito por Ferreres et ai. [ 13 ], com algumas modificações. Água e metanol foram usadas como o eluente a um caudal de 1,00 ml min ^-1 . Para conseguir uma melhor separação, um gradiente de eluição foi utilizado a partir de 30% de metanol, que permaneceu isocrático durante os primeiros 15 min, seguido de 40% de metanol em 20 min, 45% de metanol em 30 min, 60% de metanol em 50 min e 80% de metanol em 52 min antes de se tornar isocrática novamente até ao final da análise, em 60 min. Cromatogramas foram registrados em 340 e 290 nm.

Identificação de flavonóides

Os flavonóides foram identificados através de duas técnicas. Em primeiro lugar, a comparação entre cromatográfica os tempos de retenção de pico obtidos para as amostras e para os flavonóides padrão foi realizada. A técnica de adição de padrão foi também utilizado, o qual consiste na adição de quantidades conhecidas de cada padrão de flavonóides na amostra. Se houver um aumento da altura do pico, e, assim, na zona de pico, sem o aparecimento de ombros ou distorções, isto é uma forte evidência de que este pico representa o flavonóide de interesse. Uma comparação dos tempos de retenção de pico foi também realizada.

Resultados e discussão

Os ensaios de difusão em ágar

Os resultados para a atividade antibacteriana do mel de abelhas sem ferrão  M. compressipes manaosensis  (mel A) coletados durante as estações seca e chuvosa são apresentados na Tabela 2 . Pode-se observar que ambos os Gram-positivas ( S. aureus ) e Gram negativas ( E. coli, S. sonnei, P. vulgaris e  Klebsiella  sp . bactérias) foram inibidos pelo mel coletadas durante a estação seca. Muitos estudos têm demonstrado a atividade antibacteriana do mel contra bactérias Gram positivas e Gram, e  S. aureus  e  E. coli  estão entre os microrganismos mais estudados [ 2 , 14 ]. No entanto, a maioria desses estudos utilizaram o mel produzido por  Apis mellifera abelhas, e apenas alguns estudos sobre a atividade antibacteriana do mel de abelhas sem ferrão da Amazônia têm sido relatados, incluindo a investigação da influência da sazonalidade tropical em atividade antibacteriana [ 15 ].

Tabela 2.  Diâmetro da zona de inibição (mm) produzido por mel das abelhas sem ferrão  Melipona compressipes manaosensis  coletadas durante as estações seca e chuvosa para diferentes cepas de bactérias, usando ensaios de difusão em ágar

O mel coletado durante a estação seca apresentou maior atividade, inibindo cinco dos seis microorganismos, em diferentes taxas de diluição. Esta amostra de mel foi capaz de inibir as bactérias gram-positivas e gram negativas. O mel coletado durante a estação chuvosa, por outro lado, apresentaram menor atividade, inibindo apenas dois microorganismos quando não diluído. Estes resultados indicam claramente a influência da sazonalidade sobre a actividade antibacteriana do mel obtido a partir de  M. compressipes manaosensis .

Durante o período chuvoso a produção de mel de alta é observada devido ao nível elevado de floração na região amazônica, o que aumenta a disponibilidade de néctar para as abelhas. A estação seca, com a ausência de chuva, é considerado um período de baixa produção de mel, já que o nível de floração é menor. Neste estudo, o mel coletado durante a estação seca apresentou uma atividade antimicrobiana superior (Tabela 2 ), sugerindo que os componentes a partir do néctar fitoquímicos pode ser relacionado com a inibição do crescimento bacteriano.

Durante a temporada de menor florescendo as abelhas são alimentadas com néctar artificial composto por uma mistura de açúcares ou de melaço de cana de açúcar para evitar perdas de colónias, devido à falta de comida natural. Portanto, as amostras de mel coletadas durante a estação seca, que apresentou atividade antimicrobiana superior, seria de se esperar para ter um percentual menor e diversidade de componentes fitoquímicos do néctar das flores. Por outro lado, as amostras de mel recolhidos durante a estação chuvosa, a qual seria mais rico nestes componentes, exibiu uma actividade antimicrobiana menor e, portanto, a diferença na actividade anti-bacteriana observada para as amostras a partir de diferentes estações de mel pode ser explicado pelo acesso do abelhas para as plantas que fornecem néctar rico em moléculas bioativas durante a estação seca ou pelas plantas resposta fisiológica à estação seca da região. Também deve ser mencionado que as amostras a partir de mel são as mesmas espécies de abelhas, e a partir dos mesmos as colónias de abelhas, recolhidos durante dois ciclos diferentes.

As abelhas das  Melipona  espécies manter o mel nas colméias em vasos, que são feitas de uma combinação de resina vegetal e cera de abelha [ 16 ]. Esta combinação pode influenciar a composição fitoquímica do mel, considerando as substâncias presentes em resinas vegetais. Este, por sua vez, pode influenciar a atividade antibacteriana de um certo mel, considerando-se que as plantas da região amazônica responder fisiologicamente às mudanças ambientais, principalmente os relacionados com a secar e que flui dos rios. Esta resposta pode conduzir à inibição da produção de algumas substâncias, durante os períodos de fluxo de rio, para favorecer a nutrição da planta e crescimento ou para aumentar a produção de substâncias de defesa e manutenção durante o período seco, a fim de garantir a sobrevivência [ 17 ]. Estas substâncias podem ser depositados no mel através do contato direto com os vasos produzidos pelas abelhas. No entanto, as quantidades destas substâncias transferidos para o mel pode ser demasiado pequena para proporcionar por si só a actividade antibacteriana do mel, no entanto, uma parte da actividade observada pode ser atribuída a estas substâncias presentes nos potes [ 7 ]. Neste caso, os factores de entomológicas podem contribuir para a diferença na actividade anti-microbiana, por exemplo, na presença de peróxido de hidrogénio em mel, resultante da presença de oxidase de glicose produzida pelas abelhas. O peróxido de hidrogênio é um dos fatores mais importantes associados com atividade antimicrobiana no mel [ 18 ]. Dado que a presença de peróxido de hidrogénio não foi investigada no presente estudo, não foi possível verificar se a actividade, ou foi, na verdade, devido a este composto.

Pode notar-se que alguns microrganismos patogénicos foram inibidos por mel diluída na proporção de 1:4 (20,0% v / v), 1:6 (14,3% v / v) e 1:8 (11,1% v / v), que são mais diluída do que a necessária concentração de 22%, de acordo com Chirife et ai. [ 19 ]. A concentração mínima de uma solução de açúcar necessária para impedir o crescimento da maioria das bactérias patogénicas é de 29% (w / v) juntamente com um valor de actividade de água ( _W ) de entre 0,86 e 0,89. Estes valores para a concentração de açúcar e uma _w  são equivalentes a uma concentração de 22% de mel [ 4 ].

Os resultados para a atividade antimicrobiana de três diferentes méis produzidos pela  Apis  sp. abelhas (vendido comercialmente) são apresentados na Tabela 3 .Pode-se observar que alguns microorganismos são também inibidas por este tipo de mel e que mel B apresentou a actividade mais elevada, inibindo o crescimento de cinco dos seis organismos de ensaio.

Tabela 3.  Diâmetro da zona de inibição (mm) produzido por méis comerciais de Apis  sp. abelhas para diferentes cepas bacterianas, utilizando ensaios de difusão em ágar

Os resultados apresentados nas Tabelas 2  e 3  indicam que a actividade antimicrobiana exibiu não pode ser atribuído exclusivamente à pressão osmótica de açúcares presentes no mel. Considerando-se que o mel das abelhas sem ferrão tem uma viscosidade mais baixa e apresenta uma cristalização mais lenta, quando comparadas com o mel produzido por  A. mellifera  abelhas [ 20 ], pode-se inferir que as soluções preparadas com o mel de  M. compressipes manaosensis  poderia ser ainda mais diluída do que as soluções preparadas com os méis comerciais obtidos a partir de  Apis  sp., submetidos às mesmas taxas de diluição.

É evidente que a pressão osmótica contribui para a acção de soluções de elevada concentração de açúcar, mas os resultados aqui obtidos revelam que a actividade atribuída à osmose e exercida por estes méis não é suficiente para inibir o crescimento de algumas espécies bacterianas. Assim, estes resultados indicam que há outros factores que contribuem para a actividade antimicrobiana observada.

Portanto, os resultados apresentados aqui sugerem que esta actividade pode ser atribuída aos componentes de origem entomológica e / ou de origem fitoquímico, juntamente com a pressão osmótica. Alguns autores têm sugerido que a espécie de abelha é o principal responsável pela atividade antimicrobiana[ 21 ], enquanto outros têm verificado que a região fitogeográfica é o principal fator responsável pelas diferenças observadas na atividade antimicrobiana [ 15 ]. No entanto, Bogdanov [22 ] sugeriu que ambos as abelhas e as plantas influenciam a atividade, atuando de forma sinérgica.

Comparando os resultados para a actividade das amostras de mel (Tabelas 2  e 3 ), pode ser verificado que a bactéria  S. aureus  foi inibida apenas por mel A partir da estação seca e mel D. Mel A partir de estação seca inibiu  S. aureus  de crescimento quando aplicados directamente e em duas taxas de diluição (valor CIM de 33,3% v / v). A maior zona de inibição foi observada quando as amostras foram aplicados sem diluição.  E. coli  foi inibida por todos os cinco amostras de mel, e mel B era que a amostra promoveu a maior zona de inibição (valor de CIM de 50,0% v / v).  S. sonnei  estava inibir em quatro das cinco amostras de mel e a amostra B era que promoveu a maior zona de inibição, quando em comparação com as outras amostras de mel testadas neste estudo (valor de CIM de 14,3% v / v). No entanto, vale ressaltar que a maior zona de inibição observado quando se utiliza mel A foi à taxa de diluição de 1/1. A bactéria  P. vulgaris  foi inibida por três amostras de mel, e mel B foi o exemplo que conduz ao maior zona de inibição (valor de CIM de 14,3% v / v).  Salmonella paratyphi foi apenas susceptíveis de mel B, a ser inibido até que a taxa de diluição de 1: 6 (valor de CIM de 14,3% v / v). A bactéria  Klebsiella  sp. foi inibida por três amostras de mel, e novamente mel B apresentou os resultados mais promissores (valor de CIM de 50,0% v / v).

Em geral, as maiores foram observadas zonas de inibição quando as amostras foram aplicadas sem diluição, excepto para o mel A contra  S. sonnei , mostraram que a maior susceptibly quando o mel foi utilizado a uma taxa de diluição de 1/1 (50,0% v / v). Estes resultados permitem-nos informar que o mel comercial de eucalipto (Mel B), não só inibe o maior número de microorganismos patogênicos, mas também apresentou o maior efeito sobre as bactérias testadas, uma vez que foi capaz de impedir o crescimento de bactérias em cinco dos seis taxas de diluição avaliada.

Um mel de  M. compressipes manaosensis  demonstraram um espectro de boa qualidade de actividade antimicrobiana, sendo capaz de inibir o crescimento de microorganismos (cinco por S. aureus, E. coli, S. sonnei, P. vulgaris  e  Klebsiella  sp.). Dentro dos méis comerciais, mel B produzido pela Apis  abelha (floração predominante de eucalipto) apresentou a maior actividade, também a inibição do crescimento de cinco microorganismos ( E. coli, S. sonnei, P. vulgaris, S. paratyphi  e Klebsiella  sp. ).

Ensaios macrodiluição bacterianas

Os resultados anti-bacterianos obtidos nos ensaios de amostras de mel macrodiluição são apresentados na Tabela 4 .

Tabela 4.  resultados Antimicrobianos (ensaios macrodiluição) obtidos para o mel produzido por  Melipona  abelhas sem ferrão e de méis comerciais produzidos por  Apis sp. abelhas para diferentes cepas bacterianas

A  in vitro em  estudos sobre a inibição de agentes patogénicos que infectam feridas confirmou o amplo espectro de actividade amostras de mel, no caso de tanto o método de macrodiluição [ 21 ] e no ensaio de difusão em ágar [ 15 , 18 ]. A maioria dos testes antimicrobianos aplicados ao mel que envolvem a diluição em caldo empregar a técnica de microdiluição [ 12 ], a qual é realizada numa escala menor do que macrodiluição mas utilizando os mesmos critérios de diluição aqui adoptadas.

Neste estudo, a avaliação da actividade antibacteriana foi realizada utilizando duas técnicas. Os resultados mostraram diferenças notáveis ​​na natureza da actividade antibacteriana quando os dois métodos foram comparados. Por exemplo, usando o método de difusão em ágar, foi observado que o mel A amostra coletada durante a estação chuvosa apresentou atividade antibacteriana apenas quando aplicado sem diluição contra  E. coli  e  S. sonnei  (Tabela 2 ). Quando se utiliza o método de macrodiluição, no entanto, observou-se que esta amostra de mel A mostraram inibição do crescimento de bactérias em concentrações mais baixas e contra outras estirpes (Tabela 4 ). Através do método de macrodiluição, os CBMs foram verificados nas taxas de diluição de 1:4 (20,0%) de  P. vulgaris , 1:4 (20,0%) de  S. sonnei  e 1:2 (33,3%) de  S. paratyphi  e  Klebsiella  sp. Essa diferença nos resultados pode ser observado para outras amostras de mel, tal como o mel produzido pela Jandaíra ferrão de abelha. Utilizando o ensaio em ágar, o mel produzido D actividade antibacteriana apenas quando aplicados directamente contra  S. aureus ,  E. coli  e Klebsiella  sp. (Tabela 3 ). No entanto, a aplicação do método de macrodiluição, o mel Jandaíra apresentada uma MBC à taxa de diluição de 1:8 (11,1%) de  P. vulgaris(Tabela 4 ).

Os resultados apresentados na Tabela 4  indicam que o método de macrodiluição bacteriana apresenta maior sensibilidade em comparação com o ensaio de agar-bem, provavelmente devido a uma maior mobilidade das moléculas activas do caldo líquido do que no agar. Este comportamento pode ser explicado pela possibilidade de mel a ser constituído por substâncias que não se difundem adequadamente dentro dos meios sólidos, o que poderia ocorrer devido a diferenças relacionadas com a molécula de polaridade e o meio de ágar de polaridade. No meio líquido, no entanto, esta barreira de transferência de massa é naturalmente reduzida.

Inúmeros factores podem influenciar a diferença na actividade anti-microbiana quando observada utilizando as duas técnicas. De acordo com Silveira et al. [ 23 ], é de esperar que a difusão de extractos de produtos naturais que têm características hidrófobas mais é dificultado no agar, um composto polar. Silveira et al. [ 23 ] afirmado que a difusão de produtos naturais inibida também pode estar relacionada com a sua hidrossolubilidade e peso molecular.

Considerando-se que as amostras analisadas eram de mel soluções aquosas, e considerando as características polares do meio de ágar, pode presumir-se que o solvente deve ser facilmente difundir no agar. Portanto, há uma maior possibilidade que os compostos hidrófilos presentes no mel vai difundir com facilidade, e que os compostos menos polares irá ter inibido a mobilidade, devido à incompatibilidade das polaridades. No teste de macrodiluição, o meio líquido, permite uma boa mobilidade de ambas as moléculas polares e não polares, uma vez que não existe qualquer barreira de agar, para inibir a difusão das moléculas não polares, tais como os flavonóides e fenólicos. Este pode ser um fator determinante em termos de as diferenças observadas entre os dois métodos.

A análise por HPLC

Com base nos cromatogramas obtidos para o flavonóides e os padrões de ácidos fenólicos, juntamente com a metodologia de análise empregues no presente estudo, foi possível delimitar as regiões do cromatograma foram os picos relacionados com os flavonóides e ácidos fenólicos aparecer. Os picos associados com tempos de retenção compreendidos entre 0 e 10 min correspondem a compostos de maior polaridade, uma vez que o eluente utilizado durante o início da análise de HPLC tem uma natureza polar. À medida que o tempo dos aumentos de corrida cromatográfica, a polaridade do solvente diminui e, portanto, os picos que aparecem no cromatograma correspondendo a moléculas menos polares. É importante ter em conta que a fase estacionária utilizada para estas análises foi uma coluna C18. O funcionamento começa com 30% de metanol e esta percentagem aumentou ao longo do tempo de execução de 60 minutos, chegando a 80% até ao final da análise.Assim, considerando que este gradiente de solvente, os compostos mais polares foram libertados a partir da coluna após tempos de retenção mais curtos, enquanto que os compostos menos polares foram correlacionados com os tempos de retenção mais longos. Segundo Ferreres et ai. [ 13 ], a adopção desta técnica, os picos que aparecem entre os tempos de retenção de 20 e 45 min são provavelmente os picos relacionados aos flavonóides e ácidos fenólicos. A este respeito, a figura 1  ilustra as regiões do cromatograma e polaridades correspondentes para uma amostra de mel usada neste estudo.

Figura 1.  cromatograma de HPLC para a amostra de mel que mostra a região do monitoramento de picos correspondentes flavonóides (340 nm).

Considerando-se que um detector de HPLC-UV tipo foi utilizado, pode-se afirmar que os componentes detectados têm grupos cromóforos. Estes componentes podem ser derivados a partir de ácidos fenólicos ou flavonóides. No entanto, outros métodos de análise específicos precisam ser empregues a fim de revelar as estruturas químicas das diferentes amostras de mel.

As condições de operação de HPLC utilizando um gradiente de metanol-água têm sido amplamente aplicada por diversos investigadores, permitindo a separação de picos de boa qualidade no cromatograma [ 1 , 24 ]. No entanto, outros solventes podem ser adotadas de acordo com a complexidade específica de cada tipo de mel.

Muitos pesquisadores com o objetivo de identificar os compostos fenólicos em mel usaram solventes aquosos com baixo pH, geralmente preparado com ácido fórmico ou acético [ 7 , 24 ]. De acordo com Michalkiewicz et ai.[ 25 ], este procedimento é usado devido à natureza acídica da maioria dos compostos fenólicos, o que significa que uma fase móvel de ácido é necessária para uma separação satisfatória dos picos, juntamente com uma redução do tempo de retenção dentro da coluna. Por outro lado, Bogdanov [ 22 ] afirmado que este método é usado principalmente em HPLC executa esse objectivo de identificar os ácidos fenólicos além de flavonóides. No presente estudo, a água foi utilizada sem a adição de ácidos e de separação satisfatória dos picos foi obtida na região do cromatograma de interesse, onde os flavonóides aparecer (Figura 2 ).

Figura 2.  perfil fenólica de amostras de mel. (A)  cromatograma HPLC a 340 nm para o mel B.  (B)  cromatograma HPLC a 340 nm para C. mel ( C ) cromatograma HPLC a 340 nm para o mel D.

Ao analisar os cromatogramas obtidos a 290 e 340 nm, e comparando os tempos de retenção por meio da sobreposição dos picos observados, foi possível detectar vários picos na região de monitorização dos flavonóides para todas as amostras de mel. No entanto, o flavonóides pinocembrina apigenina e não foram identificados em nenhuma das amostras, o que indica que estes flavonóides não estavam presentes nos tipos de mel utilizados neste estudo. Este resultado foi inesperado, uma vez que têm relatado a presença destes flavonóides no mel, principalmente no mel produzido por  Apis  abelhas sp. Isla et al. [ 26 ] encontraram pinocembrin em méis do Noroeste argentino que apresentaram efeito inibitório contra  S. aureus ,  E. faecalis ,  E. coli ,  P. aeruginosa ,  K. pneumoniae  e  M. morganii . Tenore et ai. [ 27 ] detectaram pinocembrin em diferentes amostras de mel monoflorais da Itália. A apigenina foi encontrado em amostras de mel da Croácia, de acordo com Kenjeric et al. [ 28 ] e em amostras de méis de origem botânica diferente de diferentes regiões do Sudão, de acordo com Makawi et al. [ 29 ].

No entanto, um pico para um mel com um tempo de retenção de 21,844 minutos (Figura 3 A), que é extremamente perto do pico do padrão de rutina (tempo de retenção de 22,855 minutos), foi observado (Figura 3 B).

Figura 3.  análise de HPLC de amostras de mel. (A)  cromatograma HPLC a 340 nm para o mel de abelhas sem ferrão  Melipona compressipes manaosensis .  (B)  cromatograma HPLC a 340 nm para o padrão rutina.  (C) cromatograma HPLC a 340 nm para o mel Um  (a)  ea mesma amostra após a adição padrão de rutina  (b) .

A grande semelhança entre os tempos de retenção sugere fortemente que este pico corresponde ao flavonóide rutina, que foi identificado em 340 nm (Figura 3 B).Mesmo assim, este requer a confirmação de outras técnicas analíticas para reforçar a identificação molécula.

Assim, a fim de confirmar a hipótese de que o pico com um tempo de retenção de 21,844 minutos correspondia a rutina, a técnica de adição de padrão foi utilizado, adicionando-se 10 ul do padrão de rutina com o mel numa amostra. A amostra foi adicionada com rutina foi injectada na coluna de cromatógrafo e observou-se que o pico com um tempo de retenção de 22,844 minutos aumentadas, sem deformações significativas (Figura 3 C). Esta observação sugere que o pico com um tempo de retenção de 22,844 min corresponde ao flavonóide rutina. Este procedimento foi repetido três vezes, e os mesmos resultados foram observados.

Rutina foi identificado na amostra de mel com a maior atividade antimicrobiana. Este flavonóide foi previamente identificado como o responsável pela actividade antibacteriana. Os estudos realizados por Singh et al. [ 30 ] mostraram que a rutina de  Pteris vittata  L. apresentaram atividade potente contra  B. cereus , P.aeruginosa  e  K. pneumoniae  com os valores de MIC de 0,03 mg / ml. Basile et ai. [ 31 ] verificaram que apresentam atividade inibitória rutina padrão contra  S.aureus, P. vulgaris, K. pneumoniae, E. cloacae, Pseudomonas aeruginosa, E. coli, S. typhimurium  e  E. aerogens  (MICs entre 32 e 128 ug / ml). Além disso, a rutina apresenta várias propriedades terapêuticas associadas com a melhoria dos sintomas relacionados com vasos linfáticos e insuficiência venosa, a hipertensão e as doenças hemorrágicas, em adição à acção antioxidante [ 32 ].

A rutina é um flavonóide glicosilada e pertence ao subgrupo de flavonóides, em conjunto com a apigenina e pinocembrina, que são encontrados na própolis (ou cerume) produzida por  Melipona  abelhas. Por conseguinte, estes flavonóides não estão relacionadas com a origem floral, uma vez que para a produção de própolis (ou cerume) utilizar estas abelhas exsudados e resinas produzidas por outras partes das plantas, em vez de o néctar ou pólen [ 33 , 34 ]. Isto sugere que a transferência dessas moléculas a partir da resina para o mel ocorre. Esta transferência é facilitada porque o mel de abelhas sem ferrão é armazenado em potes construídos com cerume. No entanto, factores tais como o tempo de contacto e temperatura devem ser considerados quando se estuda a proporção de flavonóides glicosiladas transferidos de cerume de mel, e que deve ser determinada se a idade mel influencia o perfil da concentração de flavonóides.

Estas observações estão de acordo com os resultados obtidos em um estudo realizado com várias espécies de abelhas sem ferrão da Venezuela [ 34 ]. No entanto, este é o primeiro relatório do flavonóide rutina estar presente no mel de abelhas sem ferrão no Brasil.

Existem vários fatores que devem ser considerando em explorar a conexão entre os flavonóides característicos do mel de abelhas sem ferrão e sobre o papel provável que jogar sobre as suas propriedades antibacterianas. Controlos precisos deve considerar a acção sinérgica de flavonóides e outros elementos de mel, devido à complexidade do produto natural.

A maioria dos picos, possivelmente correspondentes a compostos fenólicos foram observados nas amostras de mel de meliponíneos, indicando que uma maior variedade de recursos florais e resinas ou de uma composição de flavonóides mais rico em material de origem botânica, quando comparado com méis produzidos pelaA. mellifera  abelhas.

O potencial antimicrobiano de utilização de composições fenólicas em vez de moléculas fenólicas isolado é amplamente conhecida. Extractos de fenol pode ser mais activo do que os componentes isolados, uma vez que a bioactividade de um componente individual pode mudar na presença de outro componente dentro dos diferentes extractos [ 35 ], o que corresponde a um efeito sinérgico [ 36 ]. Neste trabalho foram estudadas as amostras de mel sem fracionamento para determinar a atividade antimicrobiana, uma vez que toda a amostra de mel pode ser mais ativo do que seus componentes isolados devido a este possível efeito sinérgico.

Hoje em dia, a qualidade do mel e própolis é dependente da composição química e origem floral das amostras. O conteúdo de compostos fenólicos, tais como os flavonóides e ácidos fenólicos, é fortemente influenciada pela origem floral e geográfica, para além das características locais do tempo. Por esta razão, a identificação e quantificação dos compostos fenólicos presentes no mel e própolis são de grande interesse em relação ao desenvolvimento de medicamentos, uma vez que eles provaram capacidade antimicrobiana e anti-oxidante, que pode ser atribuído aos polifenóis, tais como os flavonóides e ácidos fenólicos.

Conclusões

O mel produzido pela abelha sem ferrão  M. compressipes manaosensis  apresentou atividade antibacteriana contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. O mel comercial obtido de Apis  sp. abelhas (mel de eucalipto) apresentou a maior atividade antibacteriana. No entanto, só inibiu o crescimento de estirpes de bactérias Gram-negativas.

O método de macrodiluição foi encontrada para ser mais sensível do que o ensaio de difusão em ágar para avaliar a actividade antimicrobiana de mel. Esta descoberta indica que a actividade antibacteriana pode ser associada com os compostos não-polares, os quais apresentam uma maior resistência à difusão no ágar.

A rutina foi identificada flavonóide por HPLC apenas o mel produzido simaruba  M. compressipes manaosensis.  Este é o primeiro relato da presença de flavonóides presente em uma amostra de mel produzido no Brasil, a primeira tentativa de obter um perfil fenólico para o mel produzido por esta espécie de abelha sem ferrão. No entanto, foram observados vários picos na região do cromatograma considerado para ser associado com a região de controlo dos flavonóides, a qual pode estar relacionada com outros compostos fenólicos. Os picos característicos que apareceram na região de amostras de mel que apresentaram maior atividade antimicrobiana de monitoramento do cromatograma pode estar relacionado com as moléculas que são responsáveis ​​pela atividade antibacteriana pronunciado destes méis. No entanto, de modo a provar isto, seria necessária para separar as fracções de cada pico e testá-los separadamente.

Os nossos resultados sugerem que existe uma possível acção sinérgica dos diversos factores antimicrobianos associados mel, tais como osmose, a presença de compostos fenólicos e a produção de peróxido de hidrogénio, que actuam contra as estirpes de bactérias patogénicas testados neste estudo.

Interesses conflitantes

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.

Contribuições dos autores

RBQP realizada a coleta da amostra, realizou o teste anti-bacteriano e análise por HPLC, participou na análise de dados e elaboração do manuscrito. CAC participou da concepção do estudo, orientou a coleta de amostras e testes anti-bacteriano, participou da análise e interpretação dos dados. PMA ajudou na análise e interpretação dos dados, realizada a análise estatística e contribuiu para a revisão e tradução do manuscrito. SDJ concebeu o estudo, e participou de sua elaboração e coordenação, realizada a análise e interpretação dos resultados de HPLC e ensaios antibacteriano e criticamente revisto o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

Informações dos autores

RBQP, Mestrado em Biotecnologia, atualmente um estudante de doutorado no Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, as pesquisas sobre óleos essenciais e outros metabólitos secundários de plantas, a fim de encontrar atividade antifúngica. CAC, pesquisador sênior do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, trabalha no Laboratório de Virologia e Imunologia. PMA, Doutor em Química Orgânica, professor associado da Universidade do Estado do Amazonas, trabalha com bioprocessos e biocatálise, junto com a prospecção de moléculas biologicamente ativos de plantas e microorganismos da Amazônia. SDJ, doutor em Físico-Química, professor associado da Universidade do Estado do Amazonas, trabalha com metodologias analíticas para avaliar a biodiversidade amazônica e realiza estudos teóricos sobre moléculas biologicamente ativas.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Dra. Gislene Almeida Carvalho-Zilse, eo GPA / INPA, para fornecer o mel de abelhas sem ferrão utilizado neste estudo, e com o apoio financeiro da Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

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